細(xì)胞增殖-Brdu流式實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)原理

BrdU是胸腺嘧啶核苷類似物，在細(xì)胞DNA合成期(S期)可競(jìng)爭(zhēng)性摻入新合成的DNA鏈。通過(guò)熒光標(biāo)記的抗BrdU抗體與流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合，可精確定量處于增殖期的細(xì)胞比例

實(shí)驗(yàn)材料

• ?細(xì)胞樣本?：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞(推薦密度70-80%融合)
  

• ?主要試劑?：

• BrdU儲(chǔ)存液(10mM，溶于PBS)
  

• 抗BrdU-FITC/Percp抗體
  

• DNA酶/鹽酸處理液
  

• 7-AAD或PI染色液(用于細(xì)胞周期分析)
  

• ?儀器設(shè)備?：流式細(xì)胞儀、離心機(jī)、CO?培養(yǎng)箱
  

實(shí)驗(yàn)步驟

細(xì)胞標(biāo)記

1. 向培養(yǎng)體系加入BrdU終濃度10μM，37℃孵育30分鐘至2小時(shí)
   

2. 消化收集細(xì)胞，PBS洗滌2次
   

細(xì)胞固定與透化

1. 70%冷乙醇4℃固定30分鐘
   

2. 2M HCl室溫處理30分鐘(暴露BrdU抗原位點(diǎn))
   

3. 0.1M硼酸鈉緩沖液(pH8.5)中和
   

抗體染色

1. 抗BrdU一抗(1:100稀釋)室溫孵育1小時(shí)
   

2. PBS洗滌后加熒光二抗(避光孵育30分鐘)
   

3. 可選：加入7-AAD(5μg/mL)共染DNA
   

流式檢測(cè)

1. 上機(jī)前用40μm濾膜過(guò)濾
   

2. 流式細(xì)胞儀設(shè)置：

• FITC通道檢測(cè)BrdU(Ex 488nm/Em 530nm)
  

• PerCP通道檢測(cè)7-AAD(Ex 488nm/Em 670nm)
  

3. 采集10,000個(gè)以上細(xì)胞事件
   

數(shù)據(jù)分析

• ?雙參數(shù)分析?：BrdU+ vs DNA含量(7-AAD)，區(qū)分G0/G1、S、G2/M期細(xì)胞
  

• ?增殖指數(shù)計(jì)算?：(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%
  

• ?注意事項(xiàng)?：

• 設(shè)門排除細(xì)胞碎片
  

• 同型對(duì)照設(shè)定陰性閾值
  

技術(shù)優(yōu)勢(shì)

• 高靈敏度：可檢測(cè)<1%的增殖細(xì)胞
  

• 多參數(shù)分析：結(jié)合細(xì)胞周期和表型標(biāo)記
  

• 動(dòng)態(tài)追蹤：通過(guò)脈沖-追蹤實(shí)驗(yàn)研究增殖動(dòng)力學(xué)
  

常見(jiàn)問(wèn)題解決

• ?背景高?：延長(zhǎng)封閉時(shí)間，優(yōu)化抗體濃度
  

• ?信號(hào)弱?：增加BrdU孵育時(shí)間至4小時(shí)
  

• ?細(xì)胞聚集?：減少固定時(shí)間，增加DNA酶處理