脊髓神經(jīng)元原代培養(yǎng)的技術(shù)操作流程如下

　　脊髓神經(jīng)元原代培養(yǎng)是一種從動物胚胎或新生個體的脊髓組織中分離并體外培養(yǎng)具有功能活性的神經(jīng)元細胞的技術(shù)。該技術(shù)廣泛應用于神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)退行性疾?。ㄈ缂∥畇側(cè)索硬化癥ALS、脊髓損傷修復）、突觸可塑性、神經(jīng)藥理學及神經(jīng)毒性研究等領(lǐng)域。由于脊髓神經(jīng)元為終末分化細胞，因此原代培養(yǎng)是研究其生理與病理機制的重要手段。

　　脊髓神經(jīng)元原代培養(yǎng)的技術(shù)操作流程：

　　1、組織分離與解剖

　　在冰浴HBSS中快速取出胚胎或新生鼠的脊柱。

　　在顯微鏡下沿脊柱背側(cè)切開，小心剝離腦膜和周圍結(jié)締組織。

　　取出脊髓，置于冰預冷新鮮HBSS中漂洗2–3次，去除血膜和殘余組織。

　　2、組織消化

　　將脊髓組織剪碎成約1 mm³小塊。

　　加入預熱的胰蛋白酶溶液（37°C），消化15–25分鐘。

　　消化期間可輕柔吹打或振蕩以助解離。

　　3、終止消化與細胞懸液制備

　　加入含血清的培養(yǎng)基終止消化。

　　用移液管輕柔吹打組織塊10–15次，使細胞充分分散。

　　通過200目細胞篩網(wǎng)過濾，去除未消化的組織團塊。

　　離心（1000 rpm，5分鐘），棄上清。

　　4、細胞重懸與計數(shù)

　　用完q培養(yǎng)基（Neurobasal+B27+L-谷氨酰胺等）重懸細胞沉淀。

　　臺盼藍染色法進行活細胞計數(shù)，確?；盥?gt;90%。

　　5、接種與培養(yǎng)

　　將細胞接種于預先包被PDL或PDL/Laminin的培養(yǎng)皿或蓋玻片上。

　　接種密度：1–5×10?cells/cm²（依實驗目的調(diào)整）。

　　培養(yǎng)條件：37°C、5%CO?、飽和濕度。

　　2–4小時后，可更換一次培養(yǎng)基，去除未貼壁的死細胞和碎片。

　　6、維持培養(yǎng)

　　每3–4天更換一半培養(yǎng)基（避免完q換液導致神經(jīng)元脫落）。

　　可添加抗有絲分裂劑（如阿糖胞苷Ara-C,1–5μM）在培養(yǎng)第2–3天加入，抑制非神經(jīng)元細胞（如膠質(zhì)細胞）過度增殖。

　　培養(yǎng)周期：一般可維持14–21天，期間神經(jīng)元可形成軸突、樹突和突觸連接。